11 décembre 2025, 14h, salle Herpin, en français

Ingénierie statistique de la spécificité des protéases à sérine S1A

La conversion de spécificité enzymatique, particulièrement au sein de la famille des protéases à sérine S1A, représente un défi majeur en ingénierie des protéines. Malgré des décennies de recherche, la reprogrammation rationnelle de la fonction catalytique reste un objectif difficile à atteindre, souvent limité par une compréhension incomplète des effets allostériques et des contraintes évolutives. Cette thèse vise à décrypter la relation séquence-fonction chez ces enzymes en combinant deux approches complémentaires : (1) des criblages expérimentaux à haut débit via le tri de gouttelettes microfluidiques (FADS) et (2) la mutagenèse dirigée guidée par l’analyse computationnelle de données évolutives.

Dans un premier temps, nous compléterons le travail de Valentin Senlis sur le deep mutational scan (DMS) de la trypsine de rat [186]. L’analyse, appuyée par un modèle biophysique de l’expérience de sélection, a confirmé un paysage de fitness bimodal, où la majorité des mutations sont soit neutres, soit fortement délétères. Dans un second temps, nous interpréterons les résultats obtenus par Valentin Senlis à l’aide d’une méthode de sélection bidimensionnelle lui ayant permis d’identifier des mutations,

y compris distales, modulant le ratio de spécificité arginine/lysine. Nous apporterons des mesures quantitatives de ce ratio pour les mutants sélectionnés.

Dans un second temps, nous explorerons la capacité de modèles génératifs (DCA : Direct Coupling Analysis), entraînés uniquement sur des données de séquence, à concevoir des protéases synthétiques fonctionnelles. Cette démonstration avait déjà été apportée expérimentalement pour des enzymesappelées chorismate mutases; nous montrons ici qu’elle s’étend également à des enzymes présentant une catalyse bien plus complexe, comme les protéases à sérine. Enfin, en collaboration avec Marion

Chauveau, une approche de conception rationnelle basée sur DCA (COMBINE) a été appliquée à la conversion de spécificité [29]. Une combinaison de seulement trois mutations dans la poche de liaison a suffi à induire une conversion partielle, mais réussie de la trypsine en chymotrypsine. À l’inverse, la conversion de la chymotrypsine en trypsine est demeurée un échec, confirmant une asymétrie déjà observée dans la littérature.

En conclusion, ce travail met en évidence la complexité des trajectoires évolutives contrôlant la

spécificité enzymatique. Nos résultats montrent que des conversions de spécificité détectables peuvent être obtenues en modifiant uniquement le site actif, sans recourir à des mutations distales. Cependant, pour atteindre une activité comparable à celle de la séquence naturelle l’acquisition de mutations distales permissives semble nécessaire. Nous émettons l’hypothèse que le développement de modèles prédictifs robustes nécessitera l’acquisition de jeux de données fonctionnelles massivement annotées, malgré la difficulté expérimentale que cela représente.